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Real-Time PCR快速反应液(染料法)是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂，可对目标DNA进行快速、特异性的定量检测。优化的预混液可缩短Real-Time PCR的反应时间，适用于标准或快速PCR仪。

2×QuickFire SYBR qPCR Mix采用了抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶，配合独特的快速PCRBuffer体系可确保在所有的Real-Time PCR仪上进行灵敏的qPCR反应，具有反应快速、PCR反应时间缩短60%，同时具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点，使你在不影响PCR效果的前提下更快获得结果，节约科研时间和能源。

• 2×QuickFire SYBR qPCR Mix采用了抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶，配合特制的快速PCR Buffer体系，可大大缩短变性、退火与延伸时间，可节省多达60%的反应时间，快速获得实验结果。
  
• 本制品特制的快速PCR Buffer体系含有独特的PCR稳定因子，在不损失PCR灵敏度和特异性的基础上进行快速反应，保证了2×QuickFire SYBR qPCR Mix高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
  
• 2×QuickFire SYBR qPCR Mix中预混有SYBR Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行快速Real-Time PCR反应，操作简单方便。
  
• 本制品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。

本制品采用了特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶进行快速PCR扩增，通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的，适用于标准和快速PCR仪。

• 本制品中特异的抗体修饰热启动DNA聚合酶，95℃条件下孵育1min即可激活全部酶活，在缩短变性时间的同时避免了非特异性产物的扩增。
  
• 本制品的快速PCR Buffer体系添加了独特的PCR稳定因子，配合精心优化的快速PCR Buffer体系，可大大缩短变性、退火和延伸时间，使PCR总运行时间缩短60%，更快获得实验结果，而不影响PCR反应效果。
  
• 本制品针对cDNA模板和gDNA模板结构组成的差异，对PCR的反应步骤进行了特别的优化，使较难扩增的gDNA模板也能获得良好的PCR结果。

收到本制品后，请立即置于-30~-15℃避光保存。从-30～-15℃取出使用时，将冻存的QuickFire SYBR qPCR Mix和ROX Reference Dye融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻。(在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

• 本制品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本制品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
  
• 如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
  
• 引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
  
• 引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化，可以在0.2～0.5μM范围内调整引物浓度。
  
• 20μL反应体系中，cDNA模板的使用量一般小于100ng，基因组DNA模板量一般小于50ng，逆转录产物作为模板时，使用量应不超过PCR体系终体积的20%。

• 建立Real-Time PCR反应体系
  
  • 融解QuickFire SYBR qPCR Mix(如果保存在-20℃)、ROX Reference Dye、引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下融解并彻底混匀。
    
  • 建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。
    

    成分	50μL体系	25μL体系	20μL体系	终浓度
    2×QuickFire SYBR qPCR Mix	25μL	12.5μL	10μL	1×
    正向引物（10μM）	1.5μL	0.75μL	0.6μL	300 nM
    反向引物（10μM）	1.5μL	0.75μL	0.6μL	300 nM
    cDNA模板	-	-	-	-ng-pg
    50×ROX Reference Dye	-	-	-	-
    RNase-Free ddH2O	至50μL	至25μL	至20μL	-

    • 引物终浓度为300 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在200～500 nM范围内调整。
      
    • 几种常见仪器的匹配ROX Reference Dye浓度见下表：
      

      仪器	浓度
      ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等	5×(例如5μL ROX/50μL体系)
      ABI 7500、7500 Fast;Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等	1×(例如1μL ROX/50μL体系)
      Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等	无需添加

• 进行Real-Time PCR反应
  
  • 建议采用两步法PCR反应程序进行反应；若模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可使用三步法程序进行PCR反应。
    
    • 两步法反应程序：
      

      阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
      预变性	1	95℃	1min	预变性	否
      PCR反应	40	95℃	5sec	变性	否
      		60℃△1	15sec△2	退火/延伸	是
      熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

    • 三步法反应程序：
      

      阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
      预变性	1	95℃	1min	预变性	否
      PCR反应	40	95℃	5sec	变性	否
      		50～60℃△3	10sec	退火	否
      		72℃	15sec△2	延伸	是
      熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

    注^△1：请先使用60℃ 15sec进行扩增。如果需要进一步优化，可以尝试在56～66℃范围内进行。
    注^△2：使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作，几种常见仪器的时间设定见下表：
    

    使用ABI 7700/7900HT/7500 Fast，Roche，BioRad和Agilent等公司荧光定量PCR仪时请设定在15sec。

    使用ABI 7000和7300时请设定在31sec。

    使用ABI7500时请设定在32sec。

    注^△3：通常引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。
    
  • 盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
    
  • 将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

图1．扩增曲线，4对不同检测体系以单链cDNA为模板，利用2×QuickFire SYBR qPCR Mix	图2．熔解曲线，经qPCR测试后，通过图2熔解曲线分析，均为单一峰，未发现非特异性扩增和引物二聚体产生。cDNA合成是使用反转录试剂盒进行。
图3．使用2×QuickFire SYBR qPCR Mix的熔解曲线仅有单一峰，为特异性扩增产物，其Tm值为83.5℃；使用国外A公司试剂除了特异性扩增产物外，还出现了引物二聚体。引物二聚体的Tm值一般在75℃左右。

进行RT-PCR反应时，有三种cDNA第一链合成试剂盒可以选择，分别是反转录试剂盒，cDNA第一链合成反应预混液和cDNA第一链合成试剂盒。

反转录试剂盒可3min去除基因组DNA的残留，使基因定量结果更加真实可信，适用于模板量为50ng～2μg的总RNA的快速反转录（共需21min），是荧光定量PCR的反转录实验的优秀选择。

• 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Bu?er、RNase-Free ddH2O在室温(15～30℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
  
  • 以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
• 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
  表1．gDNA去除反应体系
  

  成分	用量
  5×gDNA Buffer	2μL
  Total RNA	-
  RNase-Free ddH2O	至10μL

• 按照表2的反转录反应体系配制混合液。
  表2．反转录反应体系
  

  成分	用量
  10×King RT Buffer	2μL
  Quicking Enzyme Mix	1μL
  FQ-RT Primer Mix	2μL
  RNase-Free ddH2O	至10μL

• 将反转录反应中的mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。
  
• 42℃，孵育15min。
  
• 95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续荧光定量PCR反应或低温保存。

• 无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体
  

  问题	分析
  DNA模板中存在抑制剂	重新纯化模板或降低模板使用量
  Mg2+浓度不合适	使用2×QuickFire SYBR qPCR Mix时，PCR反应体系中Mg2+的终浓度为2mM。对有些扩增体系，可以将Mg2+终浓度提高到5mM。进行Mg2+终浓度优化时，建议每次增加0.5mM Mg2+浓度进行实验。
  加样错误或试剂问题	检查试剂浓度和保存条件，包括所使用的引物和模板。重复进行实验。
  PCR条件、引物序列或浓度不当	请确认引物未发生降解，引物浓度及PCR条件，扩增不好时，通常先尝试降低退火温度，延长退火时间和提高引物浓度，有时也可以提高退火温度，增加延伸时间，降低升温速度。对于GC含量高的模板，可以适当延长变性时间。如果还是扩增不好，请重新设计引物。
  起始模板问题	检查起始模板的浓度，保存条件和质量。重新对模板进行线性梯度稀释，并用新稀释模板进行实验。增加起始模板使用量。

• NTC出现较高的荧光值
  

  问题	分析
  试剂污染	建议使用新试剂进行实验。
  PCR反应液配制时发生污染	采取必要的防污染策略(如使用带滤芯的枪头)。
  引物出现降解	可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。

• 出现引物二聚体和（或）非特异扩增
  

  问题	分析
  Mg2+浓度不合适	使用2×QuickFire SYBR qPCR Mix的反应体系含有Mg2+的终浓度为2mM。对有些扩增体系，可以将Mg2+终浓度增加到5mM。建议每次增加0.5mM Mg2+浓度进行优化。
  PCR退火温度太低	建议每次增加2℃进行退火温度优化。
  引物设计不合适	考虑重新设计引物序列。
  PCR产物太长	荧光定量PCR产物适宜长度在100～150bp之间，而且不应该超过500bp。
  引物出现降解	可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。
  计量误差	反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

• 定量值重现性差
  

  问题	分析
  仪器方面的故障	因为仪器的不适用，在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。
  样品纯度不好	不纯的样品会导致实验的重现性差。
  稀释的模板放置太久	通过梯度稀释的模板最好现配现用。
  引物质量下降	尽量避免新合成引物批次间的差异，可以使用原来质量好的引物做为对照。
  PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当	扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物的浓度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时，一般可降低退火温度或提高引物浓度，也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高，可延长变性时间。仍得不到改善时，建议重新设计引物。
  计量误差	反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。